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细胞色素C一些使用情况分析简述报告
点击次数:398 发布时间:2018-02-06
   细胞色素C 是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量zui为丰富。细胞色素C 位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,分子量约为13000,肽链中含有19个赖氨酸残基,为一碱性蛋白, 等电点(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠,它是一种阳离子交换剂,细胞色素C 分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷,它可与沸石分子上的钠离子发生交换,从而被沸石吸附。装入层析柱后,用25%硫酸铵洗脱,又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度,主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合,必须严格控制三氯乙酸用量。
  细胞色素C与材料试剂
  1、 设备:组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱。
  2、 仪器:剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管。
  3、 试剂:联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵。
  4、 材料:新鲜猪心(2个)。
  细胞色素C实验步骤
  1、预处理:健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中(保护酶的活性,避免捣碎机破碎时使酶失活)—→放入生理盐水中清洗去污—→称重:烧杯80g ,烧杯+猪心=240g,(240-80)×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min (匀浆3min ,停5min ,为了保证捣碎机安全)
  2、提取:搅拌后静置2h —→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中,在过滤后静置2h —→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH 至6.0,静置30min ,过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH 至7.5,静置30min, 过滤
  3、吸附:加10%人造沸石(滤液为220ml )—→磁力搅拌器搅拌吸附1h —→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→滤出人造沸石待用
  4、洗脱:在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱,流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液(没分辨出红色液体阶段,收集了所有洗脱液)
  5、盐析:在洗脱液(300ml )中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌,使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤,收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液(过滤液和20%三氯乙酸溶液zui好在4℃遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防止局部蛋白质变性)—→加完后分成8管,立即离心—→无明显沉淀,再5000转离心15min —→无明显沉淀,向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min —→无明显沉淀,实验结束
  6、透析 将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml 烧杯中(用磁力搅拌器搅拌),用去离子水透析, 除去硫酸根离子,15min 换水一次,换手3~4次后,检查硫酸根离子是否已被除尽。检查方法:取2ml 氯化钡溶液加入试管中,滴加2~3滴透析外液至试管中,若出现白色沉淀,表示硫酸根离子未除尽,如果不出现沉淀,表示透析完全。将透析液过滤, 收集滤液即为细胞色素C 粗品。 记录此粗品的体积。

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